|
"Хвойные бореальной зоны" 2008г.,№3-4, с.
295-299
Качество пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae)) на клоновой прививочной плантации в Западно- Саянском опытном лесном хозяйстве
Савельев С.С.1, Третьякова И.Н.1,2, Ворошилова Е.В.2, Череповский Ю.А.3
1Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН
660036 Красноярск, Академгородок, 50; е-mail: culture@ksc.krasn.ru
2Институт биотехнологии и фундаментальной биологии ГОУ ВПО «Сибирский федеральный университет»
660041 Красноярск, пр. Свободный, 79
3Западно- Саянское опытное лесное хозяйство
662820 Ермаковское, пл. Мира, 43
Определяли качество пыльцы, продуцируемой клонами Западно- Саянской ОЛХ и пыльцы, полученной от плюсовых и гетерозисных деревьев, растущих в Западном Саяне, использованной в качестве опылителей. Для анализа пыльцы применяли цитологические, гистохимические методы. Выявлено, что пыльца, впервые продуцируемая клоновыми деревьями кедра сибирского в 13- 14- летнем возрасте, оказалась низкого качества. Только у двух клоновых деревьев (из 23 пылящих) формировались зрелые двуклеточные пыльцевые зерна, которые прорастали в культуре invitro.
Ключевые слова: пыльца, клоны, сосна сибирская
Defining quality of pollen, produced by clones of West-Sayan experimental forestry and pollen, received from plus and heterosis trees, growing in West Sayan, used as pollinator. For analysis used cytological, histochemical methods. Discovered, that pollen, at first produced by clone Siberian pine trees at the age of 13-14, proved to be low quality. Only two clone trees (from 23 pollinate) forming double-cellular pollen-grains, that grown in culture in vitro.
Key words: pollen, clone, Siberian pine
Введение
Сосна сибирская (кедр сибирский Pinussibirica Du Tour)- перспективный орехоносный вид, один из основных лесообразователей гор Сибири. Поэтому большое значение имеет проведение генетико- селекционных работ по отбору высокоурожайных форм данного вида, а также эксперименты по искусственной внутривидовой гибридизации кедра сибирского для получения хозяйственно- ценных гибридов.
Выведение гибридов во многом зависит от подбора родительских пар (Титов, 2006). Предпосылками для успешной гибридизации кедра сибирского являются высокий полиморфизм и периодическая встречаемость кедров- акселератов, формирующих семена в год опыления (вместо двух лет) (Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990). Можно предположить, что использование пыльцы данных особей в работах по контролируемому опылению позволит получить гибриды, отличающиеся ускоренным ростом, а также обильным семеношением.
Одним из наиболее благоприятных мест для проведения контролируемого опыления являются горные районы Западного Саяна. В них на сравнительно небольшой территории в различных высотных поясах сконцентрирован чрезвычайно богатый и разнообразный генофонд этого основного
_________________
*Работа поддержана грантами № 08-04-00107-а и ККФН 18G043.
орехоплодного вида (Ирошников, 1974).
Для сохранения природного богатства кедровых лесов Западного Саяна и их биоразнообразия, в 90-х годах прошлого века на базе Западно- Саянского опытного лесного хозяйства (ОЛХ) Ю. А. Череповским была создана клоновая плантация («архив») из плюсовых и гетерозисных деревьев кедра сибирского Западно- Саянской горной страны. Проведение гибридизационных работ на клоновой плантации позволит получить высокопродуктивные гибриды с заданными наследственными свойствами.
Цель настоящего исследования - определение качества пыльцы, продуцируемой клонами Западно- Саянской ОЛХ и пыльцы, полученной от плюсовых и гетерозисных деревьев, растущих в Западном Саяне, использованных в качестве опылителей.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом настоящего исследования являются клоны деревьев кедра сибирского, произрастающие на клоновой прививочной плантации Западно- Саянского опытного лесного хозяйства, возраст которой 12- 14 лет (табл. 1). В этом возрасте на клонах впервые появились микростробилы.
Для сравнения использовали типичные и гетерозисные формы сосны сибирской, растущие в естественном древостое Западного Саяна (Ермаковский и Шушенские районы Красноярского края). Возраст деревьев из естественного древостоя составлял 100- 114 лет (табл. 2). При этом особого внимания заслуживала особь с ускоренным однолетним типом формирования шишек (1А). Такие деревья представлены в популяции редко (0,2- 0,5 %) (Ирошников, 1974).
Таблица 1 – Характеристика клонов материнских деревьев кедра сибирского (Ермаковское ОЭП)
№ клона |
Высота, м |
D1,3, см |
Возраст, лет |
277/22 |
1,5±0,2 |
15±2,5 |
13 |
280/25 |
1,6±0,3 |
16±3,1 |
13 |
281/26 |
1,5±0,4 |
15±2,6 |
11 |
286/32 |
1,6±0,2 |
16±3,2 |
13 |
287/33 |
1,5±0,3 |
15±2,4 |
14 |
288/34 |
1,6±0,3 |
16±3,1 |
12 |
157/17 |
1,5±0,2 |
15±2,5 |
11 |
155/15 |
1,5±0,2 |
15±2,1 |
10 |
142/1 |
1,6±0,2 |
16±3,1 |
13 |
144/6 |
1,6±0,3 |
16±3,0 |
12 |
145/4 |
1,7±0,3 |
17±2,8 |
13 |
147/8 |
1,5±0,2 |
15±3,1 |
13 |
153/13 |
1,8±0,5 |
18±2,8 |
13 |
141/3 |
1,7±0,3 |
17±1,9 |
14 |
Таблица 2 – Характеристика деревьев- опылителей кедра сибирского, отобранных в естественном древостое Западного Саяна
№ дерева |
Место
произрастания |
Высота, м |
Диаметр, см |
Возраст,
лет |
Длина шишек, мм |
Генеративный цикл женских шишек |
492 |
Ермаковский район |
25 |
64 |
114 |
64±0,7 |
двулетний |
476 |
-«»- |
23 |
61 |
107 |
63±0,9 |
двулетний |
22 |
-«»- |
24 |
63 |
106 |
62±0,6 |
двулетний |
1А |
Шушенский район |
23 |
69 |
103 |
48±1,8 |
однолетний |
3ш |
-«»- |
22 |
57 |
103 |
60±1,1 |
двулетний |
С клоновых деревьев и деревьев, растущих в естественном древостое, сбор микростробилов осуществляли в период растрескивания микроспорангиев (9-12 июня 2006 и 6-8 июня 2007 гг.). Микростробилы высушивали, из них вытряхивали пыльцу. Пыльцу хранили в эксикаторе, наполненном хлористым кальцием, в холодильнике при температуре 0- 5 оС.
В лабораторных условиях у пыльцы (100 пыльцевых зерен) определяли размеры пыльцевых зерен и параметры прорастания пыльцы, проводили гистохимический анализ на содержание крахмала (раствор Люголя) (Johansen, 1940). Данные о размерах пыльцевых зерен получены на основании: длины и высоты тела пыльцевого зерна и воздушных мешков. Проращивание пыльцы осуществляли в 15 %- ном растворе сахарозы и минеральной среде (Nygaard, 1969).
Для подсчета числа клеток в пыльцевых зернах, приготовленные микропрепараты окрашивали раствором сафранина по стандартной методике (Дженсен, 1965).
Просмотр микроскопических образцов осуществлялся на микроскопе МБИ-6. Размеры клеток определяли при помощи окуляр- микрометра с последующим переводом полученных единиц в микрометры (мкм). Статистическая обработка материала проводилась по стандартной методике (Паушева, 1974).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В 2006 году на отдельных 13- летних деревьях клоновой прививочной плантации впервые образовались мужские генеративные органы. В 2007 году на всех 14- летних клонах происходило формирование микростробил. В этот период клоны достигали высоты 1,5- 1,6 м, D1,3 составил 15-17 см (табл. 1).
Морфометрические показатели пыльцы
В результате исследования было показано, что пыльца всех опытных деревьев (клонов и деревьев из естественного древостоя) эллипсовидной формы и окружена двумя воздушными мешками. И по морфологии не отличается от других представителей рода Pinus.
Средние значения размеров пыльцы у деревьев- опылителей сосны сибирской из естественного древостоя варьируют по длине тела пыльцевого зерна от 50,08 мкм до 59,0 мкм, по высоте от 39,96 мкм до 55,5 мкм (табл. 3). Наиболее крупные пыльцевые зерна формировались у дерева 476 (длина пыльцевых зерен составляет 59,0 ± 0,5 мкм; высота – 55,5 ± 0,2 мкм) наиболее мелкие – у дерева 1А (длина пыльцевых зерен равна 50,08 ± 1,08 мкм, высота – 39,96 ± 0,93 мкм). Наиболее крупные размеры воздушных мешков отмечались у пыльцы дерева 22 (длина воздушного мешка составила около 43,56 ± 1,36 мкм, высота – 26,96 ± 1,10 мкм). Минимальные размеры воздушных мешков наблюдались у дерева 3ш (29,9 ± 1,48 мкм по длине и 17,10 ± 0,93 мкм по высоте).
Размеры пыльцы, формирующейся на клоновой плантации, оказались намного меньше (табл. 4). Пыльцевые зерна достигали по длине тела пыльцевого зерна 34,7±1,32 мкм (CV= 14,4 %) для клона 157/17 мкм и 44,8±1,44 мкм (CV= 14,7 %) для клона 147/8, по высоте 14,7±0,73 мкм (CV= 22,8 %) для клона 228/173 и 39,2±1,09 мкм (CV= 13,1 %) для клона 141/3. Размеры воздушных мешков также варьировали по длине 31,4±1,15 мкм (CV= 17,7 %) для клона 157/17 и 44,1±1,12 мкм (CV= 12,5 %) для 147/8, по высоте 19,9±0,84 мкм (CV= 19.3 %) для 181/141 и 27,7±0,91 мкм (CV= 11,3 %) для 147/8.
Таблица 3 – Размеры пыльцы деревьев- опылителей кедра сибирского (над чертой - М±m, мкм, под чертой - CV,%)
№ дерева |
Тело пыльцевого зерна |
Воздушные мешки |
длина |
высота |
длина |
высота |
492 |
57,50±1,30
12,60 |
40,30±1,44
19,90 |
36,40±1,03
15,80 |
25,00±0,78
17,40 |
476 |
59,00±0,50
2,90 |
55,50±0,20
1,00 |
42,20±0,44
3,60 |
22,50±0,69
4,20 |
22 |
51,30±1,93
2,88 |
51,07±1,75
2,39 |
43,56±1,36
3,33 |
26,96±1,10
3,16 |
1А |
50,08±1,08
7,60 |
39,96±0,93
11,40 |
33,12±0,91
13,40 |
18,96±0,90
23,10 |
3ш |
57,90±3,16
7,20 |
35,20±1,61
12,40 |
29,90±1,48
13,20 |
17,10±0,93
38,30 |
Средние показатели |
55,16±2,22
8,06 |
44,41±1,51
9,42 |
37,04±1,04
12,51 |
22,10±0,88
17,32 |
Таблица 4 – Размеры пыльцы клоновых деревьев кедра сибирского (над чертой - М±m, мкм, под чертой - CV,%)
№ клона |
Тело пыльцевого зерна |
Воздушные мешки |
длина |
высота |
длина |
высота |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
277/22 |
39,9±0,96
11,5 |
23,8±1,04
19,6 |
37,5±1,44
17,7 |
24,1±0,92
17,7 |
142/1 |
35,5±0,78
8,3 |
25,34±1,0
19,5 |
33,3±0,78
8,9 |
24,6±0,73
15,2 |
358/70 |
43,7±1,33
12,1 |
26,7±1,13
18,1 |
38,9±1,55
16,8 |
22,0±0,78
15,7 |
157/17 |
34,7±1,32
14,4 |
28,7±1,09
15,9 |
31,4±1,15
17,1 |
23,1±0,69
14,7 |
145/4 |
35,9±0,87
9,2 |
29,17±1,01
14,6 |
32,9±0,83
11,3 |
22,8±1,05
21,5 |
171/131. |
42,9±1,37
14,5 |
32,9±0,89
12,3 |
39,9±1,16
12,9 |
27,7±0,71
8,1 |
146/60 |
38,2±0,93
10,8 |
26,6±0,64
10,7 |
34,3±0,70
7,3 |
24,03±0,80
15,9 |
180/140 |
36,6±0,72
8,7 |
26,8±0,81
13,2 |
35±0,94
9,3 |
23,8±0,86
17,2 |
144/6 |
39,6±0,97
11,3 |
31,7±0,87
13,1 |
35,7±0,70
7,0 |
23,3±0,90
17,3 |
141/3 |
43,8±1,33
13,6 |
39,2±1,09
13,1 |
37,8±1,3
15,30 |
27,7±0,78
9,7 |
155/15 |
38,9±1,04
12,7 |
39,2±0,86
10,7 |
32,43±1,13
15,7 |
26,6±0,70
11,2 |
153/13 |
38,5±1,24
14,5 |
36,6±1,24
13,8 |
34,3±0,90
11,0 |
25,2±0,63
13,3 |
160/122 |
39,9±1,61
18,1 |
31,9±1,70
23,2 |
35,0±0,88
8,0 |
20,7±1,03
19,6 |
288/34 |
38,9±1,09
13,2 |
34,7±1,27
13,0 |
35,2±1,18
11,6 |
25,2±0,71
14,4 |
178/138 |
39,6±1,27
13,7 |
31,5±1,56
22,2 |
37,1±1,26
15,6 |
24,2±0,73
15,3 |
287/33 |
38,4±0,48
5,2 |
21,5±0,67
13,1 |
33,4±1,37
19,0 |
26,7±1,18
19,5 |
208/173 |
39,6±0,90
10,3 |
19,2±0,65
15,0 |
36,9±1,06
12,9 |
21,6±0,93
15,9 |
222/31 |
38,2±0,77
8,7 |
19,3±0,90
20,7 |
32,0±1,33
18,3 |
20,8±0,97
19,6 |
181/141 |
39,4±0,71
8,3 |
17,9±0,92
21,8 |
37,9±0,85
9,9 |
19,9±0,84
19,3 |
222/32 |
37,9±0,63
6,8 |
17,3±0,79
19,0 |
32,1±0,55
7,7 |
22,3±0,82
15,1 |
147/8 |
44,8±1,44
14,7 |
37,5±1,03
12,7 |
44,1±1,12
12,5 |
27,7±0,91
11,3 |
Окончание таблицы 4
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
156/16 |
39,2±0,71
9,2 |
34,3±0,96
12,2 |
37,1±0,83
10,0 |
24,2±0,80
16,2 |
208/173 |
39,8±0,64
7,0 |
14,7±0,73
22,8 |
37,1±0,91
11,0 |
20,6±0,99
20,1 |
Интересно отметить, что размеры пыльцы дерева № 22 и клона № 277/22, полученной от этого дерева, также значительно различаются. В среднем, размеры пыльцы клоновой плантации составляют для тела пыльцевого зерна 36,29±0,54 мкм по длине и 28,13±1,53 мкм по высоте, для воздушных мешков 32,98±0,63 мкм по длине и 22,06±0,49 мкм по высоте.
Таким образом, размер пыльцы, формирующейся в первый год пыления у клонов значительно меньше по сравнению с пыльцой в естественном древостое.В целом, результаты морфометрического анализа показали, что пыльца, собранная у деревьев на клоновой плантации формировалась значительно мельче, чем пыльца, собранная с деревьев в естественном древостое (рис. 1).
Рисунок 1 – Сравнительная характеристика средних морфометрических параметров пыльцы кедра сибирского у клонов и деревьев из естественного древостоя ( - клоновые деревья;  - естественный древостой)
Прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок
Прорастание пыльцы было достаточно высоким у всех опытных деревьев. У разных деревьев прорастание колебалось от 75,4 % (дерево № 22) до 96,8 % (дерево № 492) пыльцевых зерен. Средняя длина пыльцевых трубок варьировала от 105 мкм (дерево № 22) до 164,9 мкм (дерево № 476), что также свидетельствует о высоком качестве пыльцы (табл. 5). При этом значения коэффициента вариации длины пыльцевых трубок были высокими у всех опытных деревьев.
Прорастание пыльцы у большинства клонов оказалось очень низким (табл. 6). Процент проросшей пыльцы колебался от 11,8 % (клон № 142/1) до 80,9 % (клон № 208/173). Отмечены были два клона, у которых жизнеспособность пыльцы составила 50 % (клон № 277/22) и 80,9 % (клон № 208/173). Жизнеспособность пыльцы у этих клонов почти не отличалась от жизнеспособности пыльцы деревьев из естественного древостоя.
Таблица 5 – Прорастание пыльцы деревьев- опылителей из естественного древостоя (над чертой - M±m, мкм, под чертой – СV,%)
№ дерева |
Место произрастания |
Прорастание, % |
Длина,
мкм |
|
492 |
Ермаковский район |
96,8 |
138,5±6,15
24,3 |
|
476 |
-«»- |
81,7 |
164,9±14,35
46,9 |
22 |
-«»- |
75,4 |
105,1±9,89
50,7 |
1А |
Шушенский район |
81 |
132,6±6,01
24,1 |
3ш |
-«»- |
83,3 |
138,5±9,78
39,5 |
Таблица 6 – Прорастание пыльцы клоновых деревьев сосны сибирской
№ клона |
Прорастание, % |
Длина
пыльцевых
трубок, мкм |
142/1 |
11,8 |
36,0±3,78 |
181/141 |
12,8 |
28,8±0,89 |
155/15 |
34,4 |
58,9±1,25 |
162/122 |
32,6 |
32,10±2,49 |
180/140 |
30,5 |
43,0±2,22 |
153/13 |
14,3 |
33,4±3,81 |
277/22 |
50,0 |
120,4±3,30 |
288/34 |
2,8 |
80±0,1 |
171/141 |
10,6 |
25,2± 3,71 |
208/173 |
80,9 |
57,4±3,12 |
358/70 |
37,4 |
65,3±5,91 |
144/6 |
24,8 |
22,1±6,42 |
Гистохимический показатель качества пыльцы
Гистохимический тест пыльцы опытных деревьев сосны сибирской из естественного древостоя показал умеренное накопление крахмала в теле пыльцевого зерна (рис. 2а), так как большинство пыльцы давало слабое окрашивание (78- 95 % у разных деревьев).
Пыльца от деревьев на клоновой плантации также показала умеренное накопление крахмала в теле пыльцевого зерна (рис. 2б). Однако, у четырех клонов (№ 145/4, 146/60, 153/13 и 162/22) половина тестируемой пыльцы вообще не содержала крахмала.
По результатам гистохимического окрашивания пыльцы на содержание крахмала показано умеренное накопление его в теле пыльцевого зерна. Данный показатель применяют в качестве теста, определяющего жизнеспособность пыльцы.
Цитологический анализ пыльцы с клоновой плантации
Цитологический анализ пыльцевых зерен, окрашенных сафранином, деревьев с клоновой плантации показал, что пыльца оказалась недоразвитой, одноклеточной и содержала только одно ядро вегетативной клетки (рис. 3). Только у двух клонов (№ 208/173 и 277/22) пыльцевые зерна имели двуклеточную пыльцу.
Рисунок 2 – Гистохимический тест на содержание крахмала в пыльце. А- естественный древостой; Б- клоновые плантации ( - нет окрашивания;  -слабое окрашивание;  - сильное окрашивание)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования, пыльца, впервые продуцируемой клоновыми деревьями кедра сибирского в 13- 14- летнем возрасте, оказалась низкого качества. Только у двух клоновых деревьев (из 23 пылящих) формировались двуклеточные пыльцевые зерна, которые прорастали в культуре invitro.
Таким образом, для проведения гибридизационных работ на молодой клоновой прививочной плантации необходимо использовать пыльцу с деревьев из естественного древостоя более старшего возраста.
Рисунок 3 – Одноядерная пыльца клонового дерева (146/60). Окраска сафранином. Увеличение 7х20. (Стрелкой показано ядро)
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Дженсен, У. Ботаническая гистохимия [Текст] / У. Дженсен.- М.: Мир, 1965.- 380 с.
Ирошников, А.И. Полиморфизм популяции кедра сибирского / А.И. Ирошников // Изменчивость древесных растений Сибири: сб. ст.- Красноярск, 1974.- С. 77-103.
Минина, Е.Г. Морфогенез и проявление пола у хвойных [Текст] / Е.Г. Минина, Н.А. Ларионова.- М.: Наука, 1979.- 215 с.
Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений [Текст] / З.П. Паушева.- М.: Колос, 1974.- 256 с.
Титов, Е.В. Гибридизация кедра сибирского: учеб. пособие [Текст] / Е.В. Титов.- Воронеж: Воронеж. гос. лесотехн. акад., 2006.- 127 с.
Третьякова, И.Н. Эмбриология хвойных (Физиологические аспекты) [Текст] / И.Н. Третьякова.- Новосибирск: Наука, 1990.- 157 с.
Johansen, D.A. Plant microtechnique / D.A. Johansen. - New York. - 1940.- 206 pp.
Nygaard, P. Studies in germination of pine pollen in vitro. Growth condition and effects pH and temperature on germination, tube growth and respiration / P. Nygaard // Physiol. plant. - 1969. – V. 22.- №3. –P. 338-346.
Поступила в редакцию 12 января 2008 г.
Принята к печати 27 августа 2008 г. |
