ХБЗ,2008, №1-2

Особенности роста эмбриогенного каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского

Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН
660036 Красноярск, Академгородок, 50; е-mail: culture@ksc.krasn.ru

Инициация эмбриогенного каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского проводилась с использованием мегагаметофитов и незрелых зиготических зародышей на разных стадиях их развития. Культивирование осуществлялось на среде МС с гормонами 2,4-Д, БАП и АБК. Успешность соматического эмбриогенеза была связана с генотипом дерева и зависела от стадии развития экспланта.

Ключевые слова: соматический зародыш, эмбриогенный каллус, кедр сибирский, мегагаметофит

Induction of embryogenic callus and the getting somatic embryos of Siberian pine has been conducted with megagametophytes and immature zygotic embryos at different stages its development. Culturing was made on MS medium with hormones 2,4-D, 6-BA and ABA. Success of somatic embryogenesis of Siberian pine connected with tree genotypes and depends on the stage of explants development.

*Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 06-04-08040 ОФИ; ККФН и РФФИ № 07-04-96810

Введение

Кедр сибирский (Pinussibirica Du Tour) является одним из основных лесообразователей в горах Южной Сибири. За последние годы этот единственный орехоносный вид в данном регионе подвергается хищническому истреблению из-за антропогенной нагрузки. Вместе с тем половая репродукция кедра сибирского характеризуется рядом особенностей, затрудняющих его возобновление:
- процесс созревания семян характеризуется длительным репродуктивным циклом (27 мес.);
- семена являются полиэмбриональными, относятся к труднопрорастаемым и требуют стратификации (4-7 мес.);
- в природных популяциях кедра сибирского встречаются отдельные уникальные гетерозисные генотипы деревьев, у которых наблюдается сильная акселерация генеративного цикла (от опыления до оплодотворения проходит 2 мес., вместо 1 года, наблюдаемого в норме). Однако размножение таких гетерозисных форм естественным путем невозможно из-за отсутствия зародыша вследствие гаметофитной несовместимости (Третьякова, 1990).
Для регуляции эмбриональных процессов, направленных на преодоление стерильности семян и выращивание полноценных сеянцев у кедра сибирского, наиболее перспективным способом является использование микроклонального размножения в культуре in vitro и особенно путем соматического эмбриогенеза. Разработка биотехнологии соматического эмбриогенеза и получение соматических зародышей у кедра сибирского до сих пор не проводилась.
Соматический эмбриогенез - это асексуальный способ размножения, основанный на тотипотентности растительных клеток, был открыт 20 лет назад у Piceaglaucа (Durzan et al, 1987). Этот феномен побуждает на исследование процессов дифференцировки и дедифференцировки растительных клеток, закономерностей детерминации в раннем онтогенезе. Эмбриогенные клеточные линии сохраняют компетентность длительный период времени и позволяют получить генетически однородный селекционный материал улучшенных форм и проводить их массовое тиражирование. Клональное размножение хвойных через соматический эмбриогенез является одним из перспективных направлений в решении проблем лесовосстановления.
К настоящему времени эмбриогенный каллус у хвойных был получен у 16 видов рода Pinus, у 11 видов рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 6 видов и гибридов рода Larix, а также у Pseudotsuga menziesii (Klimaszewska,. Cyr, 2002). В качестве источника соматических клеток, для индукции соматического эмбриогенеза у хвойных, использовались мегагаметофиты, зрелые и незрелые зародыши и их отдельные органы (семядоли и гипокотиль), хвоя молодых растений (Lelu et al, 1994), а также сегменты вегетативных побегов взрослых деревьев (Malabadi, Staden, 2005). В данной статье впервые приводятся результаты исследования по индукции соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов и изолированных незрелых зиготических зародышей кедра сибирского и цитологический контроль этого процесса.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объекты исследований. Деревья кедра сибирского произрастают в естественном древостое Западного Саяна и на клоновых прививочных плантациях Западно-Саянского опытного лесного хозяйства (с. Ермаковское Красноярского края). Для взятия образцов использовались 8 деревьев-доноров №№ 1т, 2т, 8, 277/22 и три клона: 26, 28, 22 (черенки взяты с дерева 277/22) – свободноопыленные и 22х1А – клон 22, опыленный пыльцой материнского гетерозисного дерева с однолетним циклом развития женских шишек (№ 1А). Возраст деревьев из естественного древостоя составил 100-110 лет, на клоновых плантациях – 14 лет. Со всех опытных деревьев производился сбор шишек в разные периоды их развития (начиная с периода оплодотворения до полного развития семян).
Растительный материал. В качестве эксплантов для индукции соматического эмбриогенеза использовались мегагаметофиты и зиготические зародыши на разных стадиях их формирования (см. табл.), полученных в результате свободного опыления и при контролируемом опылении. Мегагаметофиты извлекали из семян и стерилизовали гипохлоритом натрия или раствором йода с 90% спиртом (1:3), с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Зародыши извлекали из мегагаметофитов в стерильных условиях и помещали на питательную среду.

Таблица – Стадии эмбриогенеза зиготического зародыша в период сбора шишек (дата оплодотворения - конец первой декады июня)

Стадия развития	Размер зародыша	Продолжительность развития после оплодотворения (нед.)
Оплодотворение. Проэмбрио	0	1 нед.
Ранний эмбриогенез - кливаж - глобулярное эмбрио	4-16 клеток 0,5-1 мм	2 нед. 4 - 5 нед.
Поздний эмбриогенез - стадия торпедо - предсемядольная стадия - формирование оси зародыша	1,5-2 мм 3 мм 4 мм	6 нед. 7-8 нед. 8-9 нед.
Зародыш семян в период созревания шишки	5-10 мм	10-12 нед.
Зрелый зародыш (окончание периода стратификации)	11-12 мм	16-17 нед.

Методика получения соматических зародышей у хвойных включает ряд последовательных стадий, требующих определенного состава сред и гормональных добавок: инициация эмбриогенного каллуса (ЭК), пролиферация ЭК и созревание соматических зародышей. Эти стадии различаются по длительности и условиям культивирования.
Для получения эмбриогенного каллуса из мегагаметофитов и зиготических зародышей использовались базовая среда MS (Murashige, Skoog, 1962) и ? MS (среда MS с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов), с добавлением мезоинозита (0,1 г л-1), L-глютамина (1,45 г л-1), фитогормонов: 2,4-Д (0,5-2 мг л-1) и 6-БАП (0,5-1,01 мг л-1), сахарозы (30 г л-1), а также агара (7 г л-1) или Gelrite (4 г л-1). Для пролиферации эмбриональной массы концентрация 6-БАП, 2,4-Д и сахарозы снижалась в 2-4 раза. Культивирование проводилось в темноте. Для перехода соматических зародышей к созреванию были использованы безгормональные базовые среды с активированным углем (1 %) в течение 1 нед. на свету. Культивирование осуществлялось при 16-часовом фотопериоде и температуре 24±1 °С. Для созревания соматических зародышей в среды добавлялись мезоинозит (0,1 г л-1), L-глютамин (1,45 г л-1), 2,4-Д (2 мг л-1) и АБК (5-15 мг л-1), сахароза (34 г л-1), а также агар (7 г л-1).

Цитологический анализ

Для проведения цитологического анализа использовались давленые препараты. Окраска эксплантов проводилась сафранином с добавлением капли метиленового синего (Паушева, 1980). Просмотр микроскопических образцов осуществлялся на микроскопе МБИ-6. Замеры клеток и эмбриональных структур проводились при помощи окуляр-микрометра с последующим переводом полученных единиц в мкм.
Статистическая обработка данных
Для сравнения интенсивности прироста каллуса проводилось еженедельное измерение объема каллуса по формуле

V=2/3 ?SLh,

(1)

где V – объем экспланты, мм3;
S – ширина экспланты, мм;
L – длина экспланты, мм;
h – высота экспланты, мм.
Статистическая обработка данных проводилась по стандартным методикам (Лакин, 1973) при помощи программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение эмбриогенного каллуса из зиготических зародышей сосны сибирской
Введение в культуру мегагаметофитов кедра сибирского на стадии оплодотворения, проэмбрио и кливажа показало, что на 12 – 15-е сут. культивирования на микропиллярном конце гаметофита происходило формирование каллусной массы у 3 – 5 % эксплантов. В течение 3-5 нед. происходил активный рост каллуса – первоначальная масса экспланта увеличилась в 4-8 раз (рис. 1а). При введении в культуру незрелых изолированных зародышей на глобулярной стадии развития наблюдалось образование эмбриогенного каллуса только в 7-10 % случаев (рис. 1б).
Наиболее активное формирование эмбриогенного каллуса шло на предсемядольной и более поздних стадиях развития, когда длина зиготического зародыша составляла 3-4 мм, т.е. зародыш занимал ? длины коррозийной полости (конец июля - начало августа). Морфологический отклик эксплантов, введенных в культуру, был уже заметен через 4-8 сут., который выражался в формировании эмбриогенного каллуса (ЭК) по всей длине зародыша. Инициация ЭК активно шла на среде МS. На данной среде на 30-й день инициации объем эмбриогенного каллуса составил 880 - 1430 мм3 (рис. 2).

Рисунок 2 - Динамика роста эмбриогенного каллуса, полученного из зиготических зародышей разных генотипов сосны сибирской

Полученный ЭК поддерживался на пролиферационных средах (MS) без потери пролиферационной активности. На протяжении всего срока культивирования происходил интенсивный прирост ЭК, объем которого за 3-4 мес. составил 14000 – 20000 мм3. Пролиферационная активность у кедра сибирского сохранялась в течение 12 и более месяцев, и в ЭК шло интенсивное образование соматических зародышей.

Влияние генотипа дерева (клона) – донора на инициацию и пролиферацию соматического эмбриогенеза сосны сибирской

Наблюдения за динамикой роста эмбриогенного каллуса на среде MS показали, что процессы инициации и пролиферации каллуса у разных генотипов идут неодинаково (рис. 2). Прежде всего, выделились 3 дерева, произрастающих в естественном древостое Западного Саяна (№№ 1т, 2т и 8), у которых за 30 сут. инициации объем эмбриогенного каллуса не превышал 250-380 мм3, т.е. составил в 2-3 раза меньшую величину по сравнению с остальными опытными деревьями. Пролиферация каллуса у этих деревьев шла еще более медленным темпом. Следовательно, указанные деревья не способны формировать эмбриогенный каллус и в дальнейшем соматические зародыши. Остальные 5 опытных деревьев формировали эмбриогенный каллус с разной степенью активности. Через 30 сут. культивирования (конец инициации) объем эмбриогенного каллуса превышал 1100 мм3 (клон 28). Высокой эмбриогенной активностью обладали дерево № 277/22 и клон, полученный от этого дерева (№ 22), а также клон № 26. Образование ЭК клона 22х1А (клон дерева 277/22, опыленного пыльцой гетерозисного дерева 1А с однолетним генеративным циклом) шло менее активно. Объем эмбриогенного каллуса составил 420 мм3.
При пересадке на среду MS с уменьшенным вдвое содержанием фитогормонов процесс пролиферации эксплантов указанных деревьев шел также быстрым темпом. Динамика роста эмбриогенного каллуса у всех опытных деревьев кедра сибирского сохранялась. Через 50 сут. культивирования пролиферирующие эмбриогенные каллусы распадались на ряд отдельных кусочков, которые продолжали активно расти при последующих пересадках.
Таким образом, обнаруживается значительное влияние генотипа донорского дерева кедра сибирского на рост эмбриогенного каллуса и образование в нем соматических зародышей.
Заслуживает внимания тот факт, что введение зародышей семян, полученных от одной шишки дерева № 277/22, показало сильную гетерогенность образования и роста эмбриогенного каллуса в пределах одной шишки (рис. 3). Вероятно, такая разнокачественность образцов эмбриогенного каллуса в пределах одной шишки свидетельствует о сильном влиянии пыльцы, полученной от разных отцов (деревьев - опылителей).
Вызревание соматических зародышей кедра сибирского
Через 2-3 месяца культивирования экспланты поэтапно переводились из пролиферационной среды на безгормональную среду с добавлением активированного угля (1 нед.), а затем помещались на среду MS, содержащую АБК (концентрация 5- 15 мг/л). Пробирки выставлялись на свет и проводились наблюдение за появлением соматических зародышей. Через 2 нед. культивирования в данной среде на поверхности эмбриогенного каллуса отмечались появление зародышей с семядолями. На одном каллусе длиной 1,5-2 см образовывалось до 10-20 соматических зародышей. Через 1-2 мес. пребывания в данной среде соматические зародыши переносились в среду для проращивания.

Рисунок 3 – Рост эмбриогенного каллуса из эксплантов одной женской шишки генотипа 277/ 22 (свободное опыление)

Цитология возникновения эмбриогенного каллуса и соматических зародышей
Цитологический анализ показал, что при введении в культуру мегагаметофитов на стадии оплодотворения, проэмбрио и начала внедрения зародыша в зародышевый канал, клетки, составляющие каллус, были однородными, без всяких признаков дифференциации.
При введении зиготических зародышей на семядольной и последующих стадиях развития в культуру через 3-7 дней начиналось активное удлинение клеток по всей длине зародышевого корешка (рис. 4а). Через 10-12 дней длина клеток составляла 160-190 мкм по сравнению с исходной 30-70 мкм. Такие клетки похожи на эмбриональные трубки первичного суспензора зиготического зародыша (рис. 4б). Эти клетки подвергались ассиметричному делению и образовывали две клетки: одну маленькую – эмбриональную, другую длинную – эмбриональную трубку. Оба типа клеток активно делились, формируя эмбриональные глобулы (будущие соматические зародыши) (рис. 4В), которые со всех сторон были окружены длинными клетками, выполняющими гаусториальную функцию.
К концу инициации эмбриогенный каллус представлял собой эмбрионально–суспензорную массу. Он состоял из эмбриональных глобул и эмбриональных трубок. Эмбриональные глобулы и трубки подвергались кливажу, их число значительно увеличивалось в период пролиферации, и через 40-50 дней в пролиферирующем эмбриогенном каллусе возникали торпедообразные соматические зародыши. При переносе такого каллуса на безгормональную среду эмбриональные трубки отмирали, а торпедообразные соматические зародыши начинали увеличиваться в размерах и в них четко выделялась эмбриональная ось.
При переносе эмбриогенного каллуса на среду с АБК соматические зародыши приобретают четкую биполярную структуру: на одном из полюсов зародыша происходит образование апекса побега и семядолей, а на другом - апекса корешка. Через 8-12 нед. соматические зародыши появляются на поверхности каллуса (рис. 4Г).

Эмбриогенный каллус был индуцирован у 16 видов сосен, из которых только у половины были получены соматические зародыши и растения регенеранты. Соматические зародыши были получены у P. caribaea (Laine, David, 1990), P.elliottii (Newton et al 1995), P. lambertiana (Durzan, Gupta, 1987), P. nigra (Salajova et al 1995), P. palustris (Nagmani et al 1993), P. patula (Jones, Staden 1995), P. sylvestris (Keinonen-Mettala et al 1996), P. taeda (Becwar et al 1990; Litvay et al 1985), P pinaster (Bercetche, Paques, 1995), P. koraiensis (Bozhkov et al 1997), P. strobus (Finer et al 1989).

На среде с ауксинами и цитокининами частота регенерации эмбриогенного каллуса у Pinus была низкой и колебалась у P. taeda от 2 до 9 %, у P. pinaster эта частота составила 15 % (Bercetche, Paques, 1995), а у P. strobus (Finer et al 1989) составила 52,9 %. У изучаемых генотипов кедра сибирского процесс инициации эмбриогенного каллуса наблюдался у 58 % эксплантов. Однако активное образование эмбриогенного каллуса шло только у трех из восьми генотипов, у которых через 2-3 месяца культивирования наблюдалось образование соматических зародышей.
Образование ранних соматических зародышей напоминает процесс кливажной эмбрионии, ярко выраженной у зиготических зародышей сосен, в том числе и кедра сибирского (Третьякова, 1990; Singh, 1978). У последнего эмбриональные инициали зародыша, полученные от одной оплодотворенной яйцеклетки, распадаются на четыре идентичных эмбриональных единицы, каждая из которых дает начало четырем зародышам-близнецам. Простая и кливажная полиэмбрионии широко распространены у хвойных растений (Durzan, Gupta, 1987). По мнению Сарваса (Sarvas, 1962), этот феномен служит для компенсации стерильности, которая у P. sylvestris составляет 27 %. При самоопылении число стерильных семян значительно увеличивается (Koski, 1991), а при климатической флуктуации может достигать 100% (Носкова, Третьякова, 2004).
Имеются данные о том, что наблюдается наиболее эффективное получение соматических зародышей при введении в культуру in vitro эксплантов P. strobus на стадии кливажа и посткливажной стадии развития (Klimaszewska, Cyr, 2002). Однако у кедра сибирского при введении в культуру зиготических зародышей на более поздних стадиях развития, начиная со стадии инициации семядолей и до полного завершения морфогенеза (стадия опадения женских шишек), шло активное образование ЭК и соматических зародышей. Вероятно, в растительных клетках архивировано наличие кливажа, который в силу тотипотентности клеток реализуется в пролиферирующих каллусах путем активного деления эмбриональных клеток (глобул) и эмбриональных трубок под действием гормонов.

Экспериментальным путем было показано, что индукция и регенерация соматических зародышей у кедра сибирского, так же как у других видов хвойных – процесс многоступенчатый, включающий применение разнообразных химических соединений и многочисленных гормональных предобработок, так же как у других видов хвойных (Белоруссова, Третьякова 2008). Наиболее проблематичным остается стадия созревания соматических зародышей. В опытах культивирования зиготических зародышей представителей сосен этот процесс шел на средах с высокой концентрацией АБК (120 ?М) (Lelu, 1994). В экспериментах с кедром сибирским использовалось АБК в значительно меньших концентрациях (40-60 ?М), при этом возникали единичные соматических зародыши. При использовании более высоких концентраций АБК наступал некроз эмбриогенного каллуса. В настоящее время нами проводятся исследования по совершенствованию биотехнологии получения соматических зародышей кедра сибирского.
Таким образом, у кедра сибирского впервые были получены эмбриогенный каллус и соматические зародыши из незрелых половых зародышей. Успех получения соматических зародышей был связан с генотипом дерева – донора. Следовательно, для инициации эмбриогенного каллуса и получения соматических зародышей необходимо проведение, прежде всего, отбора генотипов, обладающих повышенной способностью к регенерации. При этом наиболее перспективным направлением является проведение работ по гибридизации с использованием улучшенных материнских и отцовских деревьев, дающих высокопродуктивное потомство. Проведение работ по введению гибридных зародышей в культуру in vitro, получение из них эмбриогенного каллуса, соматических зародышей и растений - регенерантов будет способствовать получению высокопродуктивных чистых линий (может быть даже сортов) кедра сибирского, единственного орехоносного вида в Сибири, для коммерческого плантационного выращивания.

Главная

Исследовательские группы

Студенту

Цитологический анализ

Влияние генотипа дерева (клона) – донора на инициацию и пролиферацию соматического эмбриогенеза сосны сибирской