Главная

Исследовательские группы

Научно-практический журнал
Хвойные бореальной зоны
(в перечне ВАК)

Введение

С использованием метода культивирования тканей и органов растений в настоящее время создан ряд клеточных технологий, позволяющих получать ценные вторичные продукты метаболизма растений, такие, как гликозиды, алкалоиды, некоторые другие биологически активные вещества, имеющие широкое применение в качестве лекарственных препаратов, пищевых красителей, ароматизаторов и др. (Грандберг, 1987; Гринкевич, 1991).
Преимуществом создаваемых клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) является:

1. получение продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий и возможность культивирования клеток растений;
2. оптимизация и стандартизация условий выращивания.

Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях, а также онтогенеза, генетики, растительной вирусологии и др. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную биологическую массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания является преимуществами такого моделирования (Рубцов, 1971; Машковский, 1978; Гаммерман, 1990).
Применение методов культуры изолированных органов и тканей in vitro открывает большие перспективы для массового воспроизводства и сохранения ценного генофонда древесных и травянистых растительных форм с помощью клонального микроразмножения. За последние десять лет различными биотехнологическими лабораториями вводятся в культуру многие виды растений. Кроме того, создаются коллекции для их дальнейшего тиражирования, поскольку при клональном микроразмножении появляется возможность круглогодичного воспроизводства растений в требуемых количествах для целей интродукции, оздоровления и ювенилизации растительного материала. Таким образом, проблема сохранения генофонда может быть решена с помощью биотехнологических подходов (Муравьёва, 1983; Минаева, 1991; Полевой, 1978).
Настоящая работа посвящена изучению возможности введения в асептическую культуру Ephedramonosperma С.A. Meyer и Juniperussibiriсa.
Ephedramonosperma С.A. Meyer (эфедра односемянная) относится к семейству хвойниковых (Ephedraceae). Представляет собой кустарник высотой до 30 см. Цветет во второй половине мая – первой половине июня, семена созревают в конце августа. Место произрастания – сухие каменистые склоны, каменные степи (Муравьёва, 1983).
Jniperus sibiriсa (можжевельник сибирский) представлен семейством кипарисовых (Cupressaceae F.W.Neger). Двудомный, густоветвистый, низкорослый, стелющийся кустарник. Побеги легко укореняются, они невыраженно трехгранные с укороченными междоузлиями, кора буроватая, хвоя игольчатая, серповидная, прижатая к ветвям, узколанцетная, колючая. Шишкоягоды 2-3 семянные, шаровидные, до 12 мм в поперечнике, темно синего или черного цвета, семена светло-бурые, трехгранные, на спинке сетчато-морщинистые, длиной 4-5 мм (Минаева, 1991).

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ КУЛЬТУРЫ

При работе с культурами клеток необходимо вести контроль роста и жизнеспособности культуры. При культивировании каллусной ткани для одного измерения обычно используют от 3 до 10 повторностей (пробирок с растущим эксплантом).
В работе при проведении оценки роста культуры использовали независимую выборку по 10 пробирок для обсчёта средних экспериментальных значений каждой точки на вариантах среды. Для оценки роста каллусной культуры применяли весовой метод, взвешивая на аналитических весах извлечённый из пробирки пинцетом каллус. Измерения производились каждые 4 дня (Бутенко, 1971; Катаева, 1980).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Введение в культуру invitroEphedramonosperma С.A. Meyer и Juniperussibiriсa. Обязательным условием для микроклонального размножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность. Этому условию удовлетворяют молодые побеги (8 – 12 мм) и пазушные почки стеблевого происхождения (5-7 мм).
На начальном этапе важно было подобрать оптимальные условия для стерилизации эксплантов Ephedramonosperma С.A. Meyer и Juniperussibiriсa. В результате эксперимента было установлено, что наиболее приемлемым стерилизующим агентом для Juniperussibiriсa оказался 0,1 % раствор диацида с добавлением твина-80 (1-2 капли на 1 л воды). А для стерилизации Ephedramonosperma С.A. Meyer была более оптимальна двухступенчатая стерилизация. На первой ступени в роли стерилизующего агента использовали 0,1 % раствор KMnO4, а на второй ступени 0,1 % раствор диацида с добавлением твина-80 (1-2 капли на 1 л воды). Стерилизация при этих условиях составила 97 %. Стерильные побеги вводили на агаризованные питательные среды с минеральным составом по Murashige and Skoog (1962), Schenk and Hildebrandt (1972), Uata (1939), Knop (1865) и Sierlis (1964) без добавления регуляторов роста. Полученные результаты эксперимента показали, что наиболее благоприятной средой для культивирования эксплантов оказалась питательная среда, содержащая соли по Murashige and Skoog (MS) с добавлением 30 г/л сахарозы и витаминов: пиридоксина, тиамина хлорида и ниацина в количестве по 1мг/л (Бутенко, 1971; Катаева, 1980; Гутман, 1980).
Известно, что наиболее важными компонентами питательной среды, определяющими каллусогенез, являются регуляторы роста. Для культивирования Ephedramonosperma С.A. Meyerи Juniperussibirica в условиях invitro были использованы регуляторы роста.
Каллусогенез инициировали из молодых побегов Ephedramonosperma С.A. Meyer и Juniperussibirica на средах с различными концентрациями 2,4-Д (2,4-Дихлорфенокси-уксусная кислота), ?-НУК (?-Нафтилуксусная кислота), 6-БАП (6-Бензиламинопурин) и КИН (6-Фуфуриламинопу-рин (кинетин)). Присутствие в питательной среде экзогенного регулятора 2,4-Д оказало наибольшее влияние на процесс инициации каллусогенеза можжевельника сибирского и эфедры односемянной. Образование каллусной ткани эфедры односемянной происходило на средах с присутствием ?-НУК и 6-БАП, чего не наблюдалось на эксплантах можжевельника сибирского. Полученные результаты свидетельствуют о том, что культуру можжевельника можно отнести к ауксинозависимой, а культуру эфедры односемянной как к ауксинозависимой, так и цитокининзависимой.
Представляло интерес сравнения химического состава интактного растения и каллусной ткани Ephedramonosperma С.A. Meyerи Juniperus sibiriсa, полученной при культивировании на питательной среде Murashige and Skoog.
Сравнение химического состава интактного растения и каллусной ткани Ephedramonosperma С.A. Meyerи Juniperus sibiriсa приведено в таблице 1.

Таблица 1 - Групповой химический состав интактного растения и каллусной ткани Ephedramonosperma С.A. Meyerи Juniperus sibiriсa

Из результатов таблицы 1 следует, что наибольшую часть в каллусной ткани Ephedramonosperma С.A. Meyer в отличие от интактного растения составляют экстрактивные вещества 28,45 %, зольные компоненты 9,95 %, легкогидролизуемые полисахариды 28,18 %. А каллусная ткань Juniperus sibiriсa наиболее богата лигноподобными веществами 22,41 %, в отличие от интактного растения. По другим компонентам группового состава хвоя и каллусная ткань Juniperus sibiriсa незначительно отличается.
Наибольшую ценность в каллусной ткани и интактном растении представляют биологически активные вещества. Содержание некоторых биологически активных веществ Ephedramonosperma С.A. Meyerи Juniperus sibiriсa приведено в таблице 2.

Таблица 2 – Содержание биологически активных веществ в интактном растении и каллусной ткани Ephedramonosperma С.A. Meyerи Juniperus sibiriсa

Наименование компонента	Содержание компонента, % к абсолютно сухой массе
	Ephedra monosperma С.A. Meyer		Juniperus sibiriсa
	Интактное растение (одревесневший стебль)	Каллусная ткань	Интактное растение (хвоя)	Каллусная ткань
Сапонины	4,205±0,04	2,410±0,05	0,310±0,09	0,190±0,08
Флавоноиды	0,021±0,04	0,050±0,04	0,028±0,02	0,135±0,02
Алкалоиды	0,041 ±0,08	1,128±0,03	0,290±0,01	0,710±0,06
Витамин Р	0,910±0,06	1,614±0,01	4,680±0,06	5,520±0,05
Витамин С	0,001±0,02	0,002±0,09	21,780±0,08	11,520±0,04
Дубильные вещества	1,871±0,08	1,993±0,05	5,400±0,06	6,780±0,08