Главная

Исследовательские группы

Научно-практический журнал
Хвойные бореальной зоны
(в перечне ВАК)

Введение

Важной задачей современной экологии является выработка стратегии фитосанитарной оптимизации процессов лесовосстановления, направленной на обеспечение и внедрение новейших средств борьбы в систему интегрированной защиты растений. Наиболее распространенным и вредоносным заболеванием при выращивании сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири является инфекционное полегание. Это заболевание вызывается грибами различных родов: Fusarium, Alternaria, Botrytis, Pythium, Phytophtora, Verticillium, Rhizoctonia и Cladosporium. Наибольшую опасность для всходов и сеянцев хвойных представляют грибы рода Fusarium. Вызываемые видами этого рода заболевания включают поражение наземной и корневой части растений. Наиболее сильно страдают посевы хвойных (Pinus, Picea и Larix), в меньшей степени – посевы лиственных пород [1-4].
Составной частью стратегии защиты является разработка биологического метода, основанного на сохранении и насыщении биоценозов антагонистически активными в отношении фитопатогенов микроорганизмами. Биометод, в широком понимании, подразумевает изменение количественного, видового состава и взаимоотношений популяций микроорганизмов, а также влияние метаболитов на патогенную микробиоту при различных способах использования биопрепаратов в общей технологии возделывания культур. В настоящее время имеется небольшое количество работ, в которых приводятся сведения об использовании актиномицетов в защите от почвенных грибов – фитопатогенов сельскохозяйственных культур и сеянцев древесных растений. Большинство работ посвящено изучению возможности использования отдельных представителей рода Streptomyces в качестве потенциальных агентов биоконтроля [5-9]. Многие актиномицеты являются активными антагонистами фитопатогенных грибов. Субстратный мицелий актиномицетов может проникать в ткани растений, не только поражая возбудителей различных заболеваний, но и предоставляя растению некоторые метаболиты, оказывающие оздоравливающий эффект. Известно, что антибиотические вещества, выделяемые актиномицетами, могут накапливаться в растениях, при этом повышается бактерицидность растительного сока и устойчивость растения к инфекциям [5-7].
К микроорганизмам-продуцентам биопрепаратов, представляющих собой живую культуру, предъявляются определенные требования. Они должны выживать и размножаться в новых для них условиях существования, выдерживая конкуренцию со стороны постоянных обитателей почвенного микробоценоза. При этом они должны сохранять высокие агрессивные и патогенные свойства селективно по отношению к объекту воздействия биопрепарата, не подавляя при этом безвредную сапротрофную микрофлору и не разрушая структуру почвенного микробного сообщества [1,2, 7,10,11].
Во всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений представлено некоторое количество актиномицетов – потенциальных продуцентов препаратов защиты растений. Новый штамм актиномицета Streptomyces felleus, выделенный из зоокомпоста, является антагонистом по отношению к фитопатогенным грибам и рекомендован для получения биопрепарата арилина. Штамм Р-21 актиномицета Streptomyces chrysomallus, выделенный из почв Прибалтики (Литва) и отобранный по признакам антагонистической и фиторегуляторной активности, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР (коллекционный номер 150) и предназначен для получения полифункционального биопрепарата против фитопатогенных грибов и вирусов, стимулирующего рост и развитие растений [12].
В Сибирском государственном технологическом университете из почвы лесного питомника Красноярского края выделен штамм 19/97М Streptomyces lateritius Sveschnikova и впервые предложен для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria [13]. Однако внедрение полученного перспективного штамма возможно только при массовом получении на его основе биопрепарата. С этой целью проводятся исследования по разработке биотехнологии и подбору питательных сред для его культивирования.
При выявлении потенциальных возможностей микроорганизмов образовывать антибиотические вещества подбору сред необходимо уделять самое серьёзное внимание. К настоящему времени предложено большое количество сред для культивирования актиномицетов. Недостатком этих сред является то, что на них также хорошо растут и многие бактерии. Для изучения разнообразия почвенных актиномицетов рекомендуют среды, содержащие в качестве углеродного субстрата крахмал, моно- и дисахара, процеженный отвар картофеля, пептон, гороховую муку, мясной, кукурузный, дрожжевой экстракт и другие [14,15]. В сравнении с другими бактериями почвенные актиномицеты более устойчивы к высушиванию и могут развиваться при низкой влажности питательного субстрата (8-10%). За исключением термофилов, актиномицеты характеризуются сравнительно небольшой скоростью роста даже в условиях лабораторных культур и достаточного снабжения легкоусвояемыми питательными веществами.
Перспективным биотехнологическим процессом получения биомассы актиномицетов может быть твердофазная ферментация растительных материалов [16]. Твердофазная ферментация – микробиологический процесс, протекающий в массе измельченного и влажного твердого сырья, имеющего различную форму и размеры частиц. Субстрат, используемый для твердофазной ферментации, должен содержать доступные питательные вещества для роста микроорганизмов: целлюлозу, крахмал, сахара – в качестве источников углерода; аммиак, мочевину, белки – в качестве источников азота, и минеральные соли.
По своим физическим свойствам субстрат может быть практически нерастворимым в воде (например, опилки), набухать в ней, принимать гелеобразное состояние или даже частично растворяться (например, крахмал), а также обладать достаточной влажностью. Влага может пропитывать частицы или образовывать пленку на их поверхности. Эффективность метода твердофазной ферментации зависит от используемого сырья, типа целевого продукта, особенностей микробной культуры и других причин. В мировой практике известны несколько технологических вариантов твердофазной ферментации, направленных на промышленное получение синтезируемых микроорганизмами ферментов, биологически активных веществ, антибиотиков и обогащенных белком кормовых препаратов [14-16].
Для массовой наработки биопрепарата путем твердофазной ферментации в разных странах мира используются: зерно, отруби, солома пшеницы и сорго, свекловичный жом, торф, гуза-пая (коробочки хлопка, после сбора хлопковой ваты), шелуха подсолнечника и стебли кукурузы, виноградные выжимки. Состав сред оказывает существенное влияние на рост микроорганизмов [16]. Исследований по использованию остатков древесной массы (коры, опилок, хвои) для культивирования актиномицетов крайне мало. В связи с этим целью работы было провести подбор питательных сред для культивирования антагонистически активного штамма 19/97М Streptomyces lateritius и оценить его активность после культивирования на различных питательных субстратах.

Объекты исследования

Объектами исследования служил штамм 19/97М вида Streptomyces lateritius (ВКПМ Ac 1637), выделенный из почвы лесного питомника Красноярского края. Для оценки антибиотической активности в качестве тест-объекта использовали изолят Fusarium oxysporum. Изучение биологической активности метаболитов штамма проводили на семенах Larix sibirica L.

Методы выращивания продуцента

Изучение процесса микробного биосинтеза обычно начинается с исследования динамики роста периодической культуры. Цикл развития периодической культуры начинается с засева среды. Засев осуществляется в таком количестве, которое обеспечивает начало роста микроорганизмов с минимальной задержкой или даже лаг-фазы. Оценку антибиотической активности штамма 19/97М Streptomyces lateritius на шестые сутки культивирования на твердых субстратах осуществляли путем высева продуцента на жидкую крахмало-аммиачную среду.

Процесс твердофазного культивирования осуществляли на древесной зелени пихты, коре лиственницы и коре пихты после СО2- экстракции, каждую из которых использовали в виде трех фракций: 0,25-1 мм, 1-3 мм, 3-5 мм. Культивирование проводили в конических колбах на 500 мл на субстратах (20 г), увлажненных до 80 %, добавляли разные источники азота (NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3) и подвергали стерилизации. Субстраты инокулировали агаровыми блочками штамма 19/97М Streptomyces lateritius. Культивирование проводили при температуре от 25 до 27 ?С в течение 30 сут. После культивирования исследуемого штамма массу тщательно перемешивали, образцы в количестве 1 г смывали водой в объеме 50 мл. Учет продуктивности штамма проводили определением численности колониеобразующих единиц (КОЕ) методом посева серийных разбавлений из смыва с 1 г полученного продукта после культивирования на твердых питательных средах.
Биологическую активность препарата изучали на водных экстрактах. Для получения экстрактов продукт после твердофазного культивирования штамма 19/97 M Streptomyces lateritius помещали в стерильную воду в количестве 1 г на 50 мл и экстрагировали в течение 24 часов при температуре 28-30 ?С. Полученный экстракт использовали для оценки на токсичность в отношении семян лиственницы сибирской и антибиотическую активность в отношении тест-фитопатогена.
Семена растений выдерживали в экстрактах в течение 24 ч при температуре 25 °С. Для каждого варианта брали по 50 семян в четырехкратной повторности. После суточного замачивания семена раскладывали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри, увлажняли равным количеством водопроводной воды и проращивали в течение 5-7 дней при постоянной температуре. Учитывали показатели энергии прорастания и всхожести семян. Токсичными считаются вещества, вызывающие снижение всхожести семян или угнетение роста проростков и корней не менее чем на 30 % по сравнению с контролем.
Сохраняемость штамма в полученном продукте определяли при хранении его в течение 6 месяцев. Биомассу штамма 19/97M Streptomyces lateritius, полученную на твердых питательных субстратах (древесная зелень, кора пихты, кора лиственницы), помещали в стерильные бюксы, высушивали в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 40 °С в течение шести суток. По истечении данного времени проводили оценку жизнеспособности штамма ежемесячно на модифицированной крахмало–аммиачной среде методом посева серийных разбавлений из смыва с 1 полученного продукта. Численность Streptomyces lateritius пересчитывали по значениям титров после хранения в сравнении с исходным.

Результаты и их обсуждение

Получение биопестицидов в настоящее время является трудно решаемой задачей, так как не разработаны технологии массового наращивания продуцентов. Большая часть продуцентов биологических препаратов защиты растений представляет собой продуценты на основе грибов. Для получения биопрепаратов на основе актиномицетов подобные исследования не проводились. В связи с этим представлялось интересным оценить способность штамма 19/97 M Streptomyces lateritius расти на твердых питательных субстратах.
Исследования показали, что для культивирования лучше использовать растительные субстраты размером фракций 1-3 мм, фракции других размеров менее эффективны для роста Streptomyces lateritius с целью получения биопрепаратов. Продуцент хорошо растет на коре лиственницы и древесной зелени пихты, о чем свидетельствовали показатели его численности (рис. 1). В массе коры лиственницы и на древесной зелени пихты, начиная с четвертых суток культивирования, появляется пигмент, синтезируемый продуцентом.
Численность актиномицета уже на 10-е сутки культивирования на древесной зелени пихты составляла 1,91·1011  КОЕ·г-1, а на 30 - е сутки – 2,19·1011 КОЕ·г-1. На коре пихты численность продуцента была существенно ниже, хотя имела вполне высокий титр для использования в почве в качестве биологического пестицида. Таким образом, данные доказывают, что кору хвойных, а также древесную зелень пихты можно использовать в качестве питательных субстратов для твердофазной ферментации с целью накопления биомассы продуцента.

Рисунок 1 –Динамика численности (КОЕ) штамма 19/97 М  Streptomyceslateritiusна растительных субстратах в течение 40 суток

Комплекс метаболитов, выделяемый актиномицетом, содержит ряд веществ, обладающих способностью стимулировать рост и прорастание семян хвойных. Результаты исследований, проведенных на семенах лиственницы,  показали, что большое количество этих веществ выделяется актиномицетом при твердофазном способе культивирования микроорганизма. Метаболиты актиномицета при культивировании на коре хвойных после СО2-экстракции и древесной зелени пихты оказывают лучшее действие на прорастание семян лиственницы сибирской, чем метаболиты при выращивании продуцента на стандартной среде (табл. 1). Кроме того, штамм не теряет свою антибиотическую активность в отношении тест-фитопатогена Fusarium oxysporum, вызывающего фузариоз сеянцев хвойных.
Штамм хорошо сохраняет свою жизнеспособность в полученном препарате в течение шести месяцев хранения при температуре 21-22 °С, с титром на древесной зелени - 2,2·1011, на коре лиственницы – 1,6·1011, на коре пихты – 0,1·1011 КОЕ·г-1 (рис.2). Достоверность различий численности по критерию Фишера при хранении нет, то есть биомасса может храниться длительный период времени, не теряя жизнеспособности.
Высокая антагонистическая активность штамма обусловливается большим количеством антимикробных метаболитов, которые штамм синтезирует в процессе культивирования. Это обеспечивает сохранение его стабильности и отсутствие инфицирования посторонней микрофолорой в смеси биомассы штамма с растительными остатками.

Таблица 1 – Биологическая активность водных экстрактов из биомассы штамма 19/97М  Streptomyceslateritius после твердофазного культивирования

Водный экстракт	Зона подавления роста (мм) Fusariumoxysporum	Энергия прорастания семян Larixsibirica L.	Всхожесть семян Larixsibirica L.	Инфицируемость семян Larixsibirica L.
Streptomyces lateritius на коре пихты	12,7±1,4	68,7±3,4	78,7±3,4	6,0±0,7
Streptomyceslateritius на коре лиственницы	10,7±1,7	62,5±3,4	76,5±2,7	2,2±0,1
Streptomyceslateritius на древесной зелени пихты	14,7±1,2	66,7±3,4	84,2 ±3,7	1,6±0,4
Метаболиты штаммаStreptomyceslateritius на среде Чапека	9,3±1,5	58,7±3,4	82,7±1,7	2,4±2,8
Контроль (вода)	0	46,4±2,8	66,4±2,8	7,4±0,8