Главная

Исследовательские группы

Научно-практический журнал
Хвойные бореальной зоны
(в перечне ВАК)

Введение

Грибы вида Armillaria mellea (Vahl ex. Fr.) P. Kumm. являются ценным пищевым продуктом и лекарственным сырьем. В Китае плодовые тела этого гриба используют для профилактики и лечения депрессии, головной боли, судорог, обморочных состояний, неврастении, бессонницы (Guo, 2008). В лечебных целях выращивают культуру ткани, содержащую, по данным исследователей, ряд ценных метаболитов. Исследованы также составы плодовых тел и микоризы. При этом обнаружены алифатические кислоты в свободном и этерифицированном виде (Yilmaz, 2006), дитерпеновые соединения, преимущественно кислого характера (Ayer, 1987), стерины и тритерпеноиды (Guo, 2007; Guo, 2008), пигменты и флюоресцентные ароматические соединения (Ayer, 1987; Ebrahimzadeh, 1995), полипренолы и долихолы (Кукина, 2007), полиолы и углеводы (Birkinshaw, 1948) и другие биологически активные вещества.
Алифатические кислоты в основном в виде жиров представлены пальмитиновой, олеиновой, стеариновой и арахидиновой кислотами, доминирует линолевая кислота, содержание линоленовой незначительно. Непредельные кислоты преобладают над насыщенными (Yilmaz, 2006). Кроме того, среди липидов обнаружены азелаиновая и орселлиновая кислоты и глицерин-моноолеат (Yang, 1991). В составе дитерпеновых соединений идентифицированы дегидроабиетиновая кислота, пимаровая, изопимаровая, сандаракопимаровая, левопимаровая, 7-оксо-дегидроабиетиновая, 7-оксо-15-гидрокси-дегидроабиетиновая кислоты, а также эндо-пероксид (Ayer, 1987). Среди тритерпеновых соединений идентифицированы 3?-гидроксифриделан-2-он, 5?,6?-эпокси-24(R)-метилхолеста-7,24-диен-3?-ол, 6,9-эпокси-эргоста-7,24-диен-3?-ол, эргостерин, 5,8-эргостерин-пероксид, небольшие количества ?-ситостерина и стигмастерина (Guo, 2007; Guo, 2008). Обнаружено три оранжевых пигмента: аустоцистин F, аверуфин и аверуфанин, а также флюоресцентные соединения ароматической природы (Ebrahimzadeh, 1995) и сесквитерпеновые эфиры 4'-метилмелледональ, армилларитин и армилларивин (Yang, 1991). Нами также впервые обнаружены заметные количества полипренолов и долихолов (Кукина, 2007). Полиолы идентифицированы как D-эритритол и D-маннитол Birkinshaw, 1948; Yang, 1991). В составе экстрактов Armillariamellea обнаружена также уникальная армилляриевая кислота, обладающая антибиотическими свойствами против грам-положительных бактерий и дрожжевых грибов (Obuchi, 1990).
Однако детальное изучение морфологических особенностей плодовых тел Armillariamellea позволило выделить несколько отдельных видов, отличающихся, в частности, строением спор, формой и расположением чешуек на шляпке, формой ножки. Теперь перед химиками стоит задача изучения химического состава каждого вида, так как эта информация отсутствует в литературе.
Целью нашей работы было изучение состава липофильных компонентов эфирного экстракта плодовых тел опенка серого (ArmillariacepistipesVelen.) и сравнение его с литературными данными поArmillariamellea. В литературе сведения о химическом составеArmillariacepistipes практически отсутствуют. Armillariacepistipesотносится к классу Базидиомицеты – Basidiomycetes – высшие грибы с многоклеточным мицелием. Половое спороношение – базидиоспоры – экзогенные споры, сидящие на особых выростах мицелия – базидиях. Подкласс Холобазидиомицеты – Holobasidiomycetidae – грибы с неразделенной одноклеточной булавовидной или цилиндрической базидией. Группа порядков Гименомицеты – Hymenomycetidae, где базидии соединены в тесный палисадный слой – гимений.

Экспериментальная часть

Сырье заготовлено на юге Красноярского края в сентябре 2006 года. Идентификация сырья проведена по морфологическим критериям, наиболее полно обобщенным в обзоре (Павлов, 2006), и не вызывает сомнения. Сравниваемые виды отличаются размерами и формой шляпки, цветом и расположением чешуек, формой и размерами ножки, цветом и формой кольца. Так, у Armillariamelleaкольцо толстое, прочное, уArmillariacepistipes при росте плодового тела редуцируется до полного исчезновения. Различны и микроструктуры исследуемых видов: базидии Armillariacepistipes отличаются от базидий Armillariamellea наличием пряжек.
В ходе работы плодовые тела грибов фракционированы вручную на шляпки и ножки, каждая фракция измельчена при помощи шнековой дробилки и проэкстрагирована метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) в аппарате Сокслета. Выход эфироэкстрактивных веществ из ножек опенка серого 8,5 %, из шляпок – 6,8 %. Липофильные компоненты отделены от водорастворимых экстракцией вода:гексан или вода:МТБЭ. Экстракт ножек содержал не менее 60 % водорастворимой фракции. В составе экстракта шляпок преобладали жиры.
Липофильные компоненты исследовали при помощи хроматомасс-спектрометрии (ХМС). Липофильная часть экстракта ножек грибов разделена на кислые и нейтральные составляющие путем омыления водно-спиртовым раствором щелочи. Навеска исследуемого экстракта весом 1 г растворялась в 10 мл омыляющей смеси, содержащей     15 % едкого кали, 10 % дистиллированной воды и 75 % этилового спирта по весу. Смесь кипятили на магнитной мешалке с подогревом при интенсивном перемешивании в колбе, снабженной обратным холодильником с водяным охлаждением, в течение 1,5 часов. После окончания реакции (контроль вели по ТСХ до исчезновения фракции сложных эфиров) реакционную смесь разбавляли водой в 4 раза и экстрагировали в делительной воронке свежеперегнанным метил-трет-бутиловым эфиром (4?20 мл). Объединенные эфирные вытяжки отмывали на делительной воронке дистиллированной водой (4?20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и вакуумировали. Водный слой подкисляли расвором соляной кислоты до РН=2, затем экстрагировали МТБЭ. Эфирные вытяжки отмывали водой до нейтральной реакции и вакуумировали досуха.
Кислоты переводили в метиловые эфиры при помощи диазометана, нейтральные компоненты исследовали без дериватизации. В экстракте шляпок Armillariacepistipes раздельно исследовали свободные и связанные кислоты. Для выделения свободных кислот концентрат липофильных компонентов экстрагировали 2 %-ным водным раствором едкого натра. Отделенный в делительной воронке водный слой подкисляли расвором соляной кислоты до РН=2, затем экстрагировали МТБЭ. Эфирные вытяжки отмывали водой до нейтральной реакции и вакуумировали досуха. Связанные кислоты извлекали из продуктов щелочного гидролиза аналогично суммарным кислотам экстракта ножек гриба. Соотношение свободные: связанные 1:14. Нейтральные составляющие извлекали аналогично Неомыляемому остатку экстракта ножек.
Исследование кислых фракций проводилось при помощи прибора Hewlett-Packard G 1800 A с масс-селективным детектором HP 5971 и колонкой HP-5 MS (30 m ? 0,25 mm ? 0,25 ?m). В качестве газа-носителя использовали гелий. Температура колонки повышалась со скоростью 4 ?/мин от 50 ? до 300 ?С и далее сохранялась в течение 30 мин. при 300 ?С.
Нейтральные компоненты анализировали без обработки при тех же условиях анализа. Для анализа полипренолов в качестве аналитического прибора использован жидкостный хроматограф Милихром с УФ?детекцией при длине волны 210 нм; колонка 6,3?0,2 см, заполненная сорбентом Lichrosorb RP?18 (зерно 5 мкм); элюент – смесь метанола с ацетоном (1:3 по объему).

Результаты и обсуждение

В составе кислой фракции из ножек грибов идентифицированы алифатические кислоты: пентадекановая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая и тетракозановая. Более половины фракции составляет линолевая кислота.
Среди нейтральных компонентов основным является эргостерин, обладающий активностью провитамина D. Кроме него, идентифицированы фунгистерин, эргоста-7,22-диен-3?-ол, (22Е)-эргоста-5,7,9(11),22-тетраен-3?-ол и сквален. Около 10 % входящих компонентов не удалось однозначно идентифицировать ввиду отсутствия в базе данных соответствующих масс-спектров.
В экстракте шляпок связанные кислоты находятся в сырье в виде жиров и эфиров с эргостерином и другими тритерпеновыми спиртами.
Среди свободных кислот преобладают пальмитиновая, пальмитолеиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, тетракозановая и 15-тетракозеновая кислоты. Кроме того, идентифицированы минорные компоненты: лауриновая, миристиновая, пентадекановая, дегидроабиетиновая, трикозановая, гексакозановая, гексакозеновая, октакозановая, триаконтановая кислоты. Около 5 % фракции составляют тритерпеновые кислоты, состав которых уточняется. Связанные кислоты представлены олеиновой, линолевой (50 % фракции), пальмитиновой, пальмитолеиноваой, стеариновой кислотами, в сумме составляющими более 90 %. Среди минорных компонентов идентифицированы лауриновая, миристиновая, пентадекановая, арахиновая, дегидроабиетиновая, тетракозановая, 15-тетракозеновая, гексакозеновая, гадолеиновая кислоты. Большинство минорных кислых компонентов, как свободных, так и связанных ранее в грибах не обнаруживались. Присутствует следовое количество фенолокислот.
В неомыляемом остатке экстракта шляпок идентифицированы эргостерин, фунгистерин, эргоста-7,22-диен-3?-ол, (22Е)-эргоста-5,7,9(11),22-тетраен-3?-ол, ланостерин, неоэргостерин, эргоста-5,8-диен-3?-ол, антраэргостатетраенол и сквален. Фракция содержит заметное количество эргона (эргоста-4,6,8(14),22-тетраен-3-она), для которого, согласно литературным данным (Lee, 2005), установлена цитотоксическая активность, а также до 5 % неустановленных ланостаноидов, масс-спектры которых отсутствуют в базе данных. Как в ножках, так и в шляпках плодовых тел гриба обнаружены при помощи ВЭЖХ полипренолы, состав и количественное содержание которых уточняется.Содержание полипренолов и долихолов в экстракте Armillariacepistipesсущественно ниже, чем в Armillariamellea.
Гидрофильная фракция экстракта ножек гриба состоит преимущественно из эритритола, применяемого в промышленности и фармакопее в качестве низкокалорийного сахарозаменителя. В экстракте шляпок эритритол практически отсутствует. При этом эритритол – спирт с общей формулой C4H10O4 является наиболее удобным сахарозаменителем ввиду чрезвычайно низкой калорийности. Если маннитол, сорбитол, ксилитол при сладости от 45 до 90 % по сравнению с сахарозой имеют калорийность 300-400 ккал/100г, то эритритол, сладость которого составляет 70 % от сладости сахарозы, имеет калорийность 20 ккал/100г. Это происходит из-за того, что всасывание эритритола происходит по другому механизму, чем у сахаров и полиолов. В результате эритритол можно употреблять без риска ожирения и гипергликемии. Эритритол не вызывает угрозы кариеса, не обладает побочными действиями, присущими другим полиолам: горьким привкусом, слабительным и мочегонным эффектом.
Одним из источников получения полиолов являются грибы, в которых обнаружены в значительных количествах маннитол и эритритол. При экстракции этого вида сырья спиртами получают полиолы в виде смеси. Использование в качестве экстрагента метил-трет-бутилового эфира позволяет выделить эритритол селективно. Из литературы известно о более высоком содержании сахароспиртов и сахаров в ножках базидиомицетов. Экстракт ножек Armillariaметил-трет-бутиловым эфиром представляет собой светло-желтое масло, из которого при концентрировании выпадает кристаллический осадок. Перекристаллизация из метил-трет-бутилового эфира или фракционирование экстракта на липофильные и гидрофильные компоненты при помощи гексана и воды приводит к выделению белых кристаллов с температурой плавления 89-91? С, что совпадает с литературными данными для эритритола. Чистота и строение выделенного соединения подтверждены спектрами ЯМР 1Н и 13С.

Заключение

Таким образом, среди кислых фракций экстрактов опенка серогоArmillariacepistipesидентифицированы 11 алифатических кислот, ранее не обнаруженных в Armillariamellea.
Нейтральные компоненты неомыляемого остатка содержат, согласно данным ХМС, помимо известных ранее, 9 тритерпеновых соединений, в том числе эргон (эргоста-4,6,8(14),22-тетраен-3-он), проявляющий цитотоксическую активность.
Полученные данные свидетельствуют о различиях в химическом составе опенка осеннего (Armillariamellea) и опенка серого (Armillariacepistipes) и могут служить дополнительным критерием при систематике видов Armillaria.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Кукина, Т.П. Полипренолы некоторых гомобазидиальных грибов (HOMOBASIDIOMYCETIDAE) / Т.П. Кукина, И.А. Горбунова, И.И. Баяндина // Химия растительного сырья. – 2007. – № 3. – С. 33-38.
Павлов, И.Н. Морфологические признаки грибов комплекса Armillariamellea sensu lato в Циркумбореальной области / И.Н. Павлов, А.Г. Миронов, Н.П. Кутафьева // Хвойные бореальной зоны. – 2006. – № 3 . – С. 14-21.
Ayer, W.A. Metabolites of the honey mushroom, Armillaria mellea / W.A. Ayer, J.B. Macaulay // Can. J. Chem. – 1987. – Vol. 65. - N 1. – P. 7–14.
Birkinshaw, J. H. Biochemistry of the wood-rotting fungi 5. The production of d-threitol (l-erythritol) by Armillaria mellea (Vahl) Quelet / J. H. Birkinshaw, C. E. Stickings, P. Tessier // Biochem J. – 1948. – Vol. 42. - N 3. – P.329–332.
Ebrahimzadeh, H. Isolation and Characterization of Six Highly Intrinsic Fluorescent Metabolites in Armillaria mellea (Vahl. Ex. Fr.) Karst / H. Ebrahimzadeh, G.R. Haddadchi // Journal of sciences. Islamic republic of Iran. – 1995. – Vol.6. - N 2. – P.67-79.
Guo, W.J. Steroids from Armillaria mellea / W.J.Guo, S.X. Guo // Химия природн. соедин. – 2008. – № 3. – С.322.
Guo, W.J. Triterpenes and steroids from Armillaria mellea Vahl. ex Fr./ W.J.Guo et al // Biochemical Systematic and Ecology – 2007. – Vol. 135. – №11. – P. 790-793.
Lee, W.Y. Cytotoxic Activity of Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one from the Sclerotia of Polyporus umbellatus / W.Y. Lee and other // Bull. Korean Chem. Soc. – 2005. – Vol. 26. - N 9. – P. 1464-1466.

Obuchi, T. Armillaric acid, a new antibiotic produced by Armillaria mellea / T. Obuchi et al // Planta Med. – 1990. – Vol. 56. - №2. – P. 198-201. Yang, J.S. Chemical constituents of Armillaria mellea mycelium. VII. Isolation and characterization of chemical constituents of the acetone extract / J.S.Yang et al // Yao Xue Xue Bao. – 1991. – Vol. 26. - №2. – P. 117-122.

Yilmaz, N. Fatty acid composition in some wild edible mushrooms growing in the middle Black Sea region of Turkey / N. Yilmaz et al // Food Chemistry. – 2006. – Vol. 99. - №1. – P. 168-174.