Главная

Исследовательские группы

Научно-практический журнал
Хвойные бореальной зоны
(в перечне ВАК)

Введение

Как известно, важную роль в метаболизме азотистых соединений в растениях выполняют аминокислоты. Основная функция этих соединений – участие в качестве структурных элементов в синтезе белка. Количество протеиногенных аминокислот, входящих в состав белка невелико - всего 20, в то время как общее количество свободных аминокислот, идентифицированных в тканях растений, исчисляется сотнями (Гудвин, Мерсер,1986). Как правило, когда обсуждается количественный и качественный состав свободных аминокислот в тканях растений, внимание исследователей акцентируется на протеиногенных аминокислотах и их функциях в метаболизме. Между тем показано, что значительная доля пула свободных аминокислот хвойных представлена непротеиногенными аминокислотами, состав которых изменяется в зависимости от вида и условий местопроизрастания (Schneider et al., 1996, Судачкова и др., 2007).
Цель работы привлечь внимание исследователей к этому важному компоненту пула азотистых соединений и их роли в метаболизме основных лесообразующих видов хвойных Сибири.
__________________
*Работа поддержана РФФИ (грант 07-04-00199), ККФН-РФФИ (грант 07-04-96816)
Объекты и методы исследования

Объектами исследований в зависимости от поставленных задач был подрост, а также деревья I-II класса возраста сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), лиственницы сибирской (LarixsibiricaLedeb.), и лиственницы Гмелина (Larixgmelinii (Rupr.) Rupr.) из подзон северной тайги (Туруханск, Тура), южной тайги (Красноярск) и лесостепи (Минусинск) в интервале 87-100° в.д. и 53-65° с.ш. в Центральной Сибири.
В опытах с созданием стрессовых условий путем охлаждения, подсушивания и затопления ризосферы объектом исследования был 8-13-летний подрост сосны обыкновенной в окрестностях г. Красноярска. Охлаждение корневых систем подроста достигалось путем сохранения снежного покрова под теплоизоляционным слоем, в результате чего оттаивание почвы было задержано на два месяца. В эксперименте, имитирующем почвенную засуху, опытный участок изолировали от поступления осадков и внутрипочвенного стока. Гипоксический стресс создавали путем затопления емкости площадью 30 м2 из гидроизоляционного материала с заранее пересаженным в нее самосевом сосны, в контрольной емкости влажность поддерживали близкой к естественной. В различных экспериментах проводились биохимические исследования разных органов и тканей: хвои текущего года у сосны и хвои ауксибластов у лиственниц «хвоя I», однолетней хвои сосны и хвои брахибластов у лиственницы «хвоя II», камбиальной зоны, включающей слой собственно камбиальных инициалей и ксилемных производных камбия, не закончивших дифференцировку, древесины и луба стволов и скелетных корней (последний в некоторых опытах подразделяли на две фракции: внешний, с преобладанием паренхимных элементов и смоловместилищ –«луб I» и внутренний, с преобладанием ситовидных элементов «луб II»).
Для определения свободных аминокислот 2 г навески тканей экстрагировали 80 % этанолом, экстракт выпаривали, растворяли в воде, растворимые белки осаждали хлороформом, очищенный экстракт освобождали от углеводов на колонке с катионитом КУ-2, элюат концентрировали и проводили определение на аминокислотном анализаторе ААА-339, результаты рассчитывали по стандартной смеси аминокислот.

Результаты и их обсуждение

Изучение состава азотистых соединений тканей трех основных лесообразующих видов хвойных Сибири показало, что в составе свободных аминокислот всех исследованных тканей значительно участие непротеиногенных аминокислот. В составе этой группы соединений идентифицированы ?-аминоадипиновая, ?-аланин, ?-аминомасляная, ?- аминомасляная, ?- аминомасляная (ГАМК), цистатионин, цитруллин, орнитин и оксипролин. Распределение непротеиногенных аминокислот по тканям вначале исследовалось нами на примере лиственницы Гмелина из северных местообитаний (рис. 1). Было показано, что участие непротеиногенных аминокислот в общем пуле свободных аминокислот в хвое превышает 40 %, в лубе и камбиальной зоне ствола 50 %. В тканях корней и древесине ствола доля непротеиногенных аминокислот резко падает, варьируя в пределах 17-24 %.

Рисунок 1 – Доля непротеиногенных аминокислот в составе свободных аминокислот различных тканей лиственницы Гмелина, % от суммы. 1 - хвоя, 2 - луб ствола, 3 - камбиальная зона ствола, 4 – древесина ствола, 5 – луб корней, 6 – камбиальная зона корней, 7 – древесина корней
Соотношение отдельных соединений в общем пуле непротеиногенных аминокислот также тканеспецифично. Как показано для сосны обыкновенной, в камбиальной зоне и флоэме ствола (луб II) и хвое явно доминирует ГАМК, доля которой в камбиальной зоне может достигать 95 % от суммы этих соединений, доля остальных не превышает 10 % в большинстве тканей, и только в древесине обнаружено до 30 % цитруллина и 13 % ?-аланина (рис. 2). В хвое и флоэме по сравнению с камбиальной зоной существенно участие цитруллина, орнитина и ?-аланина.

Рисунок 2 – Распределение непротеиногенных аминокислот в хвое (а), лубе (б), камбиальной зоне (в) и древесине (г) ствола сосны обыкновенной, % от суммы непротеиногенных аминокислот. 1 - ?-аминомасляная, 2 - ?-аминомасляная, 3 - ?-аминомасляная, 4 - цитруллин, 5 - цистатионин, 6 - ?-аланин, 7 - орнитин, 8 – ?- аминоадипиновая

Поскольку непротеиногенные аминокислоты, как отмечалось ранее, могут выполнять функции стрессовых метаболитов, сравнивали суммарное содержание этих соединений в тканях сосны и лиственницы сибирской из подзон северной и южной тайги, различающихся по температурному режиму почвы вследствие влияния на севере многолетней мерзлоты.
Закономерность в распределении непротеиногенных аминокислот по тканям, ранее отмеченная для лиственницы Гмелина, подтверждается для сосны и лиственницы сибирской: максимальная концентрация этих соединений отмечается в камбиальной зоне где доля непротеиногенных аминокислот может достигать 90 % от суммы свободных аминокислот. В лубе ствола, зрелой древесине и ассимилирующих тканях – хвое и молодом побеге доля этих соединений существенно ниже (рис.3 ).
Отмечены сезонные различия в содержании непротеиногенных аминокислот: максимальные концентрации этих соединений обнаружены весной, к осени их количество уменьшается, особенно в камбиальной зоне. Что касается различий в содержании этих аминокислот в тканях деревьев из популяций северной и южной тайги, то однозначно можно говорить о существенном возрастании их доли в древесине ствола и корней из подзоны южной тайги (Красноярск), для остальных тканей таких четких закономерностей не прослеживается.

Рисунок 3 – Содержание непротеиногенных аминокислот в тканях сосны обыкновенной (А) и лиственницы сибирской (Б) в северной (а) и южной (б) подзонах тайги, % от суммы свободных аминокислот. 1 – хвоя текущего года (хвоя ауксибластов), 2- хвоя прошлого года (хвоя брахибластов), 3 – побег текущего года, 4 - луб I ствола, 5 – луб II ствола, 6 - луб I корней, 7 - луб II корней, 8 – камбий ствола, 9 - камбий корней, 10 – древесина ствола, 11 – древесина корней

В то же время сравнение весенних данных для популяций из подзоны северной тайги (Туруханск) и лесостепи (Минусинск) обнаруживает существенное снижение доли непротеиногенных аминокислот в тканях сосны южной популяции (рис. 4), что может быть следствием больших различий температурного режима почвы в этот период в указанных лесорастительных зонах.
Сравнение содержания непротеиногенных аминокислот в тканях лиственницы Гмелина из двух экотипов: естественно дренированного и заболоченного лиственничника обнаруживает тенденцию к увеличению этого показателя в условиях корневой гипоксии (рис. 5). Таким образом, очевидно, что гидротермические условия местопроизрастания влияют на уровень непротеиногенных аминокислот.
Проверка этого предположения в эксперименте с охлаждением, затоплением и дефицитом влаги в ризосфере подроста сосны обыкновенной подтвердила его правомерность. Максимальное содержание этих соединений в надземной части деревьев отмечается в варианте опыта с затоплением (рис. 6), минимальное – под влиянием охлаждения. В корнях

Рисунок 4 – Содержание непротеиногенных аминокислот в различных органах и тканях сосны обыкновенной из подзоны северной тайги и лесостепи. Обозначения как на рисунке 3

на затоплении и засухе уровень этой группы соединений ниже, чем в надземной части, при охлаждении - намного выше.

Рисунок 5 – Содержание непротеиногенных аминокислот в различных органах и тканях лиственницы Гмелина в различных экотипах: дренированный участок - лиственничник голубично-зеленомошный, заболоченный участок - лиственничник кустарничково-сфагновый. 1 - хвоя брахибластов, 2 – побег текущего года, 3 - луб I ствола,4 – луб II ствола, 5 - луб I корней, 6 - луб II корней, 7 – камбий ствола, 8 - камбий корней, 9 – древесина ствола, 10– древесина корней, 11 – тонкие корни

Рисунок 6 - Содержание непротеиногенных аминокислот в хвое и лубе подроста сосны обыкновенной под действием различных стрессов в ризосфере, % от суммы свободных аминокислот

К числу стрессовых метаболитов из непротеиногенных аминокислот чаще всего относят ГАМК и ?-аланин. На рис. 7, 8 представлена динамика указанных аминокислот в опытах с охлаждением, дефицитом и избытком влаги в ризосфере сосны. В период пребывания корней подроста в замерзшей и оттаивающей почве (май, июнь) содержание ГАМК в лубе корней существенно снижается (рис. 7 а).
В июле и августе при температуре в корнеобитаемом слое от 2 до 5оС уровень ГАМК в корнях остается пониженным, тогда как в хвое наблюдается четырех - пятикратное, а в лубе ствола восьмикратное повышение содержания ГАМК Возможно аккумуляция ГАМК в надземной части дерева – способ депонирования азота.
Под влиянием затопления содержание ГАМК оказалось повышенным в 2 раза по сравнению с контролем только в июле в хвое текущего года, остальные органы и ткани как в этот срок, так и на протяжении всего эксперимента имели пониженный или несущественно отличающийся от контроля уровень ГАМК (рис. 7 б).

Рисунок 7 – Динамика ГАМК в хвое и лубе ствола и корней подроста сосны обыкновенной под влиянием охлаждения (а), затопления (б) и дефицита влаги (в) в ризосфере, % к контролю

Максимальный дефицит влаги в почве в нашем опыте с почвенной засухой отмечался в июле, только в этот срок наблюдалось повышение ГАМК в хвое прошлого года на 25%, в дальнейшем существенных отличий от контроля не обнаружено (рис. 7 в).
Концентрация другого стрессового метаболита ?–аланина также изменяется под действием указанных стрессов. В корнях, непосредственно подвергавшихся холодовому стрессу, отмечается постоянно пониженный уровень этой аминокислоты, как и в лубе ствола до оттаивания почвы, в то время как в хвое прошлого года наблюдается повышение ее содержания в 2 раза до оттаивания почвы и в 7-10 раз после оттаивания (рис. 8 а).
Затопление вызвало двух-трехкратное повышение ?-аланина в лубе ствола в июле и августе, в хвое прошлого года – в августе, в корнях, испытывающих гипоксию, существенного накопления по сравнению с контролем не отмечено (рис. 8 Б).
Под влиянием дефицита влаги в почве содержание ?-аланина в июле возрастало в 40 -55 раз по сравнению с контролем в хвое текущего и прошлого года и в лубе ствола, но в дальнейшем эти различия уменьшались и осенью содержание аминокислоты упало ниже контроля. В лубе корней в первый срок содержание ?-аланина несущественно отличалось от контроля, затем существенно снизилось в августе и лишь в сентябре повысилось на 60% по сравнению с контролем (рис. 8 В).

Рисунок 8 – Динамика ? – аланина в хвое и лубе ствола и корней подроста сосны обыкновенной под влиянием охлаждения (а), затопления (б) и дефицита влаги (в) в ризосфере, % к контролю

Идентифицированные в тканях исследованных видов хвойных непротеиногенные аминокислоты выполняют в растительных клетках самые разнообразные функции: участвуют в метаболизме протеиногенных аминокислот, защищают клетки от стрессовых воздействий, они не имеют кодирующих триплетов и не могут участвовать в синтезе белка, но некоторые из них обнаруживаются в составе белков и пептидов, что рассматривается как результат посттрансляционной модификации.
Например, ?-аминоадипиновая кислота в прорастающих семенах бобовых растений присутствует в составе антибиотика глиотоксина (Martinez–Villaluenga et al., 2006), защищающего растения от фитопатогенов, образование ее связано с катаболизмом протеиногенной аминокислоты лизина с участием фермента лизин-кетоглутарат редуктазы (Zhu et al., 2000).
Серосодержащая аминокислота цистатионин у голосеменных растений (Piceaabies, Ginkgobiloba) участвует в синтезе гомоцистеина – непосредственного предшественника протеиногенной аминокислоты метионина (Datko et al., 1974). Эта аминокислота обнаружена и у Pinustaeda (Hodges et al., 1968).
В свободном виде в тканях хвойных иногда обнаруживается оксипролин - аминокислота, входящая в состав белков клеточной стенки, но не имеющая кодирующего триплета и образующаяся в результате гидроксилирования пролина после включения его в состав полипептида (Lamport, 1963; Милютина и др. 1998)).
Непротеиногенные аминокислоты цитруллин и орнитин участвуют в орнитиновом цикле и являются метаболическими предшественниками протеиногенной аминокислоты аргинина, присутствующей в тканях многих видов хвойных. Ранее нами была обнаружена интенсивная аккумуляция аргинина и его предшественников в тканях сосны обыкновенной в условиях сильной засухи (Sudachkova et al. 2003). Повышенная по сравнению с другими тканями доля орнитина и цитруллина в составе непротеиногенных аминокислот в древесине свидетельствует об активном функционировании орнитинового цикла в живых элементах ксилемы хвойных.
? -Аланин – входит в состав пантотеновой кислоты (витамин В5), которая в свою очередь является компонентом коэнзима А, участвующего в процессе дыхания, синтезе жирных кислот и липидов. Показано, что ? – аланин в растениях образуется при распаде полиаминов, таких как спермин и спермидин (Rastogi, Davies, 1990), эта аминокислота является составной частью ?-аланин бетаина – сильного осморегулятора, который способен защитить растение в условиях водного дефицита, солевого или гипоксического стресса (Raman, Rathiasabapathi, 2003). Парадоксально, что при всех видах стрессовых воздействий в наших опытах не наблюдалось накопления ?–аланина в корнях, где влияние стресса должно быть наиболее сильным. Высокий уровень ?–аланина в надземной части дерева и его резкое падение к осени в эксперименте с водным дефицитом в ризосфере сосны находит объяснение в особенностях постановки опыта. Опытная площадка с подростом была изолирована от поступления воды в виде осадков и внутрипочвенного стока, но воздух свободно поступал к растениям. Поэтому в июле сухой воздух усиливал эффект почвенной засухи, конец лета и осень были дождливыми с частыми росами и туманами, что компенсировало почвенный дефицит влаги в надземной части растений. В опыте с затоплением и охлаждением корневой системы также отмечено накопление ?–аланина лишь в надземной части, что может быть следствием физиологической засухи, возникающей при гипотермии и гипоксии.
В тканях растений обнаруживаются три изомера непротеиногенной аминомасляной кислоты: ?-, ?- и ?-аминомасляные кислоты, все три изомера присутствуют в тканях исследованных нами видов хвойных. Функции этих соединений в растении активно исследуются в последние годы. Установлен ингибирующий эффект ?-аминомасляной кислоты на синтез этилена в растениях (Satoh, Esashi, 1980). Эта аминокислота входит в состав пептидов, обладающих антимикробной активностью (Brokaert et al., 1995). ?-Аминомасляная кислота проявляет фунгицидную активность, защищает растения путем активации патоген-специфических механизмов устойчивости (Cohen et al. 1994, Zimmerli et al. 2001).
Наибольшее внимание исследователей привлекает ГАМК. Увеличение содержания ГАМК наблюдается во многих растениях под влиянием разного рода стрессов: анаэробиоза, затопления, недостатка воды или минеральных веществ, низкой температуры, радиации, физических воздействий, низких значений рН, раневого стресса (Хавкин, 1964, Satya Narayan, Nair, 1990, Serraj, 1998, Судачкова и др. 2001). Показано, что ГАМК является модулятором ионного транспорта в растениях (Kinnersli, Lin, 2000) и участвует в передаче стрессовых сигналов (Shelp et al. 1999). В растениях обнаружено большое число пептидов, в которых ГАМК связана как с протеиногенными, так и непротеиногенными аминокислотами (Synge, 1968).
Увеличение содержания ГАМК как и ?–аланина отмечается только в надземной части дерева при сочетании почвенной и воздушной засухи и при пониженной температуре почвы. Это можно расценивать как стрессовую реакцию на водный дефицит. Возможно, что низкие температуры в ризосфере снижают в корнях активность глутаматдекарбоксилазы, контролирующей синтез ГАМК, но отсутствие аккумуляции ГАМК в корнях заставляет предполагать и иные функции этого соединения. В надземной части дерева избыток азота, не использованного на построение фитомассы растений в условиях низкотемпературного стресса,. Вероятно избыток аммонийного азота, не использованного в процессах новообразования и роста тканей и органов на построение фитомассы, в стрессовых условиях скапливается в хвое и стволе и может быть причиной увеличения концентрации ГАМК и ?–аланина в надземных органах. Та же причина лежит в основе аккумуляции больших количеств ГАМК в камбиальной зоне ствола и корней. В этой ткани ГАМК функционирует в качестве соединения - депонента аминогрупп, высвобождающихся из фенилаланина в процессе лигнификации камбиальных производных. Таким образом, непротеиногенные аминокислоты и особенно ГАМК - важный компонент обмена азотистых соединений в тканях древесных видов хвойных.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Гудвин, Т. Введение в биохимию растений / Т. Гудвин, Э. Мерсер. - М.: Мир, 1986. -Т.1. - 392 с.
Милютина, И.Л. Влияние эдафических условий на рост и обеспеченность метаболитами лиственницы Гмелина на мерзлотных почвах Центральной Сибири / И.Л. Милютина, Г.П. Семенова, В.В. Стасова, Н.Е. Судачкова // Лесоведение. - 1998. - № 5. - С. 3-9.
Судачкова, Н.Е. Влияние раневого стресса на состав свободных аминокислот и белков в тканях ствола сосны обыкновенной / Н.Е. Судачкова, И.Л. Милютина, Г.П. Семенова // Лесоведение. - 2001. - № 1. - С. 32-37.
Судачкова, Н.Е. Влияние стрессовых воздействий в ризосфере на состав свободных аминокислот в тканях сосны обыкновенной / Н.Е. Судачкова, И.Л. Милютина, Л.И. Романова // J. Stress Physiol. - 2007. - V.3, No 2. - P. 4-14.
Хавкин, Э.Е. Возрастные изменения свободных аминокислот и накопление g-аминомасляной кислоты в листьях бобовых растений / Э.Е.Хавкин // Физиол. растений. - 1964. - Т. 11, Вып. 5. - С. 862-866.
Brokaert, B. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as component of the host defense system / B. Brokaert, F.R.G. Terras, B.P. Cannune, R.W. Osborn // Plant Physiol. - 1995. - V. 108, No 4. - P. 1353-1358.
Cohen, J. [beta] – Aminobutyric acid induces the accumulation phatogenesis related proteins in tomato (Licopersicon esculentum L.). Plants and resistance to late blight infection caused by Phytophthora infestans / J. Cohen, T. Niderman, E. Mosinger, R. Fluhr // Plant Physiol. - 1994. - V. 104, No 1. - P. 59-66.
Datko, A.H. Homocysteine biosynthesis in green plants / A.H. Datko, J. Giovanelli, S.H. Mudd // J. Biol. Chemistry. - 1974. - V.249, No 4. - P. 1139-1155.
Hodges, J.D. Amino acids in inner bark of loblolly pine, as effected by the southern pine beetle and associated microorganisms / J.D. Hodges, J. Baras, J.K. Mauldin // Can .J. Bot. - 1968. - V.46, No.12. - P. 1467-1472.
Kinnersley, A.M. Receptor modifiers indicate that 4-aminobutyric acid (GABA) is a potential modulator of ion transport in plants / A.M. Kinnersley, F. Lin // Plant Growth Regul. - 2000. - V. 32, No 1. - P. 65-76.
Lamport, D.T.A. Oxigen fixation into hydroxyproline of plant cell wall protein / D.T.A. Lamport // J. Biol. Chem. - 1963. - V. 238, No 4. - P. 1438-1440.
Martinez – Villaluenga, C. Kinetics of free protein amino acids, free non protein amino acids and trigonelline in soybean (Glycine max L.) and lupin (Lupinus angustifolius L.) / C. Martinez – Villaluenga, Y.-H. Kuo, F. Lambein, J. Frias, C. Vidal-Valverde // Euro. Fd. Res. Tech. - 2006. - V.224, No 2. - P. 177-186.
Raman, S. B. ?-Alanine, N-methyltransferase of Limonium latifolium cDNA cloning and functional expression of novel N-methyltransferase implicated in the synthesis of the osmoprotectant ?-alanine betaine / S. B. Raman, B. Rathiasabapathi // Plant Physiol. - 2003. -V.132, No.3. - P. 1642-1651.
Rastogi, R. Polyamine metabolism in ripening tomato fruit / R. Rastogi, P.J. Davies // Plant Physiol. - 1990. -V.94 , No 3. - P. 1449-1455.
Satoh, S. Alpha-aminoibutyric acid: a probable competitive inhibitor of conversion of 1- aminocyclopropane 1-carboxylic acid to ethylene / S. Satoh, Y. Esashi // Plant Cell Physiol. - 1980. -V.21 , No 6. - P. 939-949.
Satya Narayan, V. Metabolism, enzymology and possible roles of 4-aminobutyrate in higher plants / V. Satya Narayan, P. M. Nair // Phytochemistry. - 1990. - V. 29, No 2. - P. 367-375.
Schneider, S. Soluble N compounds in trees exposed to high loads of N: a comparison of spruce (Picea abies) and beech (Fagus silvatica) under field conditions / S. Schneider, A. Gebler, P. Weber, D. von Sengbusch, U. Hanemaann, H. Rennenberg // New Phytol. - 1996. - V.134, No 4. - P. 103-114.
Serraj, R. Accumulation of g-aminobutyric acid in nodulated soybean in response to drought stress / R. Serraj, B.J. Shelp, T.R. Sinclair // Physiologia Plantarum. - 1998. - V. 102, No 1. - P. 79-86.
Shelp, B.J. Metabolism and functions of gamma-aminobutyric acid / B.J. Shelp, A.W. Bown, M.D. McLean // Trends in Plant Science. - 1999. - V. 4, No 11. - P. 446-452.
Sudachkova, N.E. Influence of water deficit on contents of carbohydrates and nitrogenous compounds in Pinus sylvestris L. and Larix sibirica Ledeb. Tissues / N.E. Sudachkova, I.L. Milyutina, G.P. Semenova // Eurasian J. For. Res. - 2002. - V. 4. - P. 1-11.
Synge, R.L.M. Occurence in plants of amino acid resudes chemically bound other-wise than in proteins / R.L.M. Synge // Ann. rev. plant physiol. -1968.- V. 19. -P. 113-136
Zhu, X. The catabolic function of the a-aminoadipic acid
pathway in plants is associated with unidirectional    activity of lysine-oxoglutarate reductase, but not saccharopine dehydrogenase / X. Zhu, G. Tang, G. Galili // Biochem. J. - 2000. - V. 351, No 1. - P. 215-220.
Zimmerli, L. (beta) – Aminobutyric acid – induced protection of Arabidopsis against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea / L. Zimmerli, J.P. Metraux, B. Mauch-Mani // Plant Physiol. - 2001. - V.126, No.2. - P. 517-527.